酶免—电扩散测定技术

一，酶联免疫电扩散测定技术的原理

酶联免疫电扩散是免疫电扩散（Immunoelectrodiffusion,简称IED）与免疫酶技术相结合的样新技术，其原理在于通过免疫电扩散，抗原与该抗原相应的IgG快速形成免疫复合物，接着用酶标记的抗IgG免疫球蛋白与免疫复合物孵育结合，然后用底物显色。

酶联免疫电扩散技术增加了免疫电扩散的灵敏度，对分析复杂的抗原反应和不同类型的免疫球蛋白，都有作用。

二，酶联免疫电扩散测定技术的程序

1，  器材与设备

电泳仪（包括电泳槽）；醋酸纤维薄膜（2.5cm×17cm）；微升吸管；大号培养皿等实验用玻璃器皿。

2，  材料与试剂

可溶性抗原溶液；该抗原相应的兔抗血清；HRP标记的抗兔IgG抗体，其中特异性抗体蛋白的浓度为1.25mg/ml;0.1mol/LpH8.2巴比妥缓冲液；0.2%Haemosol溶液；0.1mol/L Ph7.6Tris缓冲液；0.01mol/LpH7.2 PBS;洗涤液（85gNaCI,500ml巴比妥缓冲液，蒸馏水加至1000ml）;底物与供氢体溶液（H2O2与DAB－4HC1）。

3，  实验程序

⑴在醋酸纤维薄膜上用软铅笔划好点样线，每条点样线距离膜边3cm，对距11cm,在每条点样线中间用软铅笔划好点样点。

⑵在0.1mol/LpH8.2巴比妥缓冲液中浸湿，滴干水，但要保持湿润。

⑶用微升吸管点样，一点加抗原3ul（或1ul）,另一点加兔抗待测抗原的血清15ul（或5ul）,每份点样的抗原浓度为0.001－50ug.

⑷电泳条件。用湿滤纸搭桥，电泳缓冲液为0.1mol/L pH8.2巴比妥缓冲液，电流强度为1mA/cm,电泳时间为2h,抗原端接负极。

⑸电泳完毕，将薄膜浸入洗涤液30min，去多余的血清蛋白与游离抗原。

⑹将薄膜浸入0.01mol/L pH 7.2PBS中，振荡洗涤30min,取出薄膜，滴干余水。

⑺将酶标记抗体以1：50稀释。

⑻用稀释的酶标记抗体在室温孵育2h.

⑼在0.2%Haemosol溶液中振荡洗涤15min.

⑽在Tris缓冲液中振荡浸洗30min.

⑾在底物溶液中浸1min后，观察显色结果。