动物组织/细胞RNA提取试剂盒说明书

RNApure Tissue Kit

Cat. No.   K0584

保存：室温

组分说明

                                      Cat. No.                      K0584

                                      Kit Size                         50

                                      Buffer RL                       35 ml

                                      Buffer RW1                      40 ml

                                      Buffer RW2（concentrate）         11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                      Spin Column RM                   50

                                      Collection Tube（1.5 ml）          50

                                      Collection Tube（2 ml）            50

产品简介

     本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总 RNA。起始样本一般最多 30 mg 组织或 1 x 10 细7胞。本试剂盒还可回收未*纯化的 RNA、体外转录和酶促反应后得到的 RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于 200 碱基的高品质 RNA，几乎无 DNA 残留。如果要进行对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase I 在柱上进行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。

注意事项

1.  预防RNase污染，应注意以下几方面：

1） 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

2） 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

3） 配制溶液应使用无RNase的水。

4） 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量。

3.  使用前请检查 Buffer RL 是否出现结晶或者沉淀，可置于 56℃加热重新溶液。Buffer RL 在使用前请加入β-巯基乙醇，

    至终浓度为 1%。如 1ml Buffer RL 加 10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer RL 室温可保存 1 个月。

4.  第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5.  所有离心步骤如无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

6.  若下游实验对 DNA 非常敏感，建议用不含 RNase 的 DNase I（货号：YJ2090A）对 RNA 进行处理。

自备试剂：  β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）  

操作步骤

1.  样品处理

    1a.  组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350  μl Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的十分之一。

    1b  单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10 cm²培养面积加入600  μl Buffer RL，小于6 cm²加入350  μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。

1c.  细胞悬液：12,0006 rpm（～13,400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×10 ⁶-1×10⁷ 细胞加入600 μl Buffer RL

注意：，少于1）尽量除尽5×10 细细胞加入胞培养350基， 细 μl胞培 Buffer养基可能抑制 RL，反复细胞的裂解影响吹打几次，使其充分裂解。RNA产量。

             2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。

2.  样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物*分离。

3.  12000rpm离心2-5min，取上清进行下步操作。

4.  加入1倍体积（600  μl或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。

    注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。

5.  将步骤4所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

    注意：吸附柱的最大载量为100 µg不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。

6． 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1, 12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

    可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤6。

    1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

    2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混匀，配制成终体积为80  μl 的DNase I混合液。

       注意:  以上体系为按照我公司产品DNase I （K2090A）反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

8.   重复步骤7。

9.   12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

     注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

10.  将吸附柱置于一个新的无  RNase 离心管（Collection  Tube  1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入  30-50  μl

    RNase-Free Water，室温放置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 RNA 溶液，-70℃保存 RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate体积不应小于30  μl，体积过小影响回收率。

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重复步骤10。

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。

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