细菌RNA提取试剂盒说明书

RNApure Bacteria Kit

细菌RNA提取试剂盒

Cat. No.   K0536

保存：室温

组分说明

                                              Cat. No.              K0536

                                              Kit Size                 50

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM                50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

产品简介

     本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和*的缓冲系统，可从细菌或培养的动物细胞中快速提取总 RNA，30-40 分钟内即可完成反应。提取的总RNA 纯度高，没有蛋白质和其他污染，如果是对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的DNA 可利用无 RNase 的 DNase I 在柱上进行消化去除。提取的RNA 适用于RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、体外翻译等实验。

注意事项

1.预防RNase污染，应注意以下几方面：

1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

3）配制溶液应使用无RNase的水。

4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2. 提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。

3. 使用前请检查 Buffer RL 是否出现结晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前请加入β-巯基乙醇，

    至终浓度为 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl  β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer RL 室温可保存 1 个月。

4. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5. 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

6. 若下游实验对 DNA 非常敏感，建议用不含 RNase 的 DNase I（货号：K2090A）对 RNA 进行处理。

自备试剂：Lysozyme（K0887）、TE缓冲液、β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）  

操作步骤

 1. 4℃  10,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟收集菌体（菌体量最大不超过1×10⁹ ），小心去除所有上清。

     注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。

 2. 用含有Lysozyme的100  μl TE缓冲液*重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下：

TE 缓冲液中 Lysozyme 的终浓度            孵育时间

G 细菌                  400  μg/ml              3-5 分钟

                          -

G+ 细菌                3 mg/ml                   5-10 分钟

3. 加入350  μl Buffer RL（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀）。将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm离心2分钟，收集滤液，弃掉过滤柱。

 4. 向上步得到的滤液中加入250  μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 5. 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤5。

     1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

     2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10 × Reaction Buffer  和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀，  配制成终体积为80  μl的反应液。

       注意:  以上体系为按照我公司产品DNase I （YJ2090A）反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 6. 向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 7. 重复步骤6。

 8. 12,000 rpm 离心 2 分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

     注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

 9. 将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位加入30-50  μl

      RNase-Free Water，室温放置1分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）  RNase-Free Water 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤9。

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤9。

实验代做服务：