非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书（B 盒） 

【兽药名称】 通用名称：非洲猪瘟病毒荧光 PCR 检测试剂盒（B 盒） 

汉语拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe（B He） 

英文名称：African Swine Fever Virus Real-time RCR Detection Kit 商品名称：无 

【主要成分与含量】 

                       组成                       组份                    规格 

                                               荧光 PCR 反应液          1000µL/管×1 管

                                               Taq 酶                   30µL /管×1 管                                                 B 盒                   阴性对照                1000µL/管×1 管

                                               阳性对照                 1000µL /管×1 管

                                       说明书                   1 份/盒

【作用与用途】用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟病毒核酸的检测。 

【用法与判定】 1 用法 1.1 样品处理 血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 2.0g 于研 钵中充分研磨，再加 10.0mL PBS（pH7.2，含 1 万单位青霉素和 1 万单位链霉素）混匀（样品不足 2.0g 按 1:5 比例加 PBS），对处理的待检样品置 70℃，30 分钟灭活后，3000r/min，4℃离心 5 分钟， 取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。 1.2 样品存放 采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，须放置-80℃冰箱， 但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。 1.3 操作步骤 1.3.1 病毒 DNA 的提取 病毒 DNA 的提取推荐使用本公司生产的非洲猪瘟病毒荧光 PCR 检测试剂盒(A 盒)，操作步骤 参照说明书。如客户自备提取试剂，请参考相应提取试剂的使用说明书进行操作。提取好的 DNA 须在 2h 内进行 PCR 扩增，若需长期保存须放置 -80℃冰箱，但应避免反复冻融。 1.3.2 荧光 PCR 扩增 （1）从试剂盒取出荧光 PCR 反应液、Taq 酶，室温融化后，2000r/min 离心 5 秒。设所需 PCR 管数为 n（n=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照），每个测试反应体系需要 20µL 荧光 PCR 反应液 和 0.5µl Taq 酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个 PCR 管中各分装 20µL。 （2）分别向上述 PCR 管中加入 1.3.1 中制备的 DNA 溶液各 5µL，盖紧管盖，500r/min 离心 30 秒。（3）将加样后的 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，作好标记。反应参数设置： 第一阶段，预变性 95℃/3 分钟 第二阶段，95℃/15 秒，60℃/35 秒共 45 个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的 60℃延伸 时进行。 2 判定2.1 结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点 为准。对于多通道荧光 PCR 仪，选定 FAM（465-510）检测通道读取检测结果，ABI 仪器选择 FAM 兽用无荧光淬灭基团。 2.2 质控标准 2.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 2.2.2 阳性对照的 Ct 值应小于等于 28，并出现典型的扩增曲线。 2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 2.3 结果判定 2.3.1 阴性：无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。 2.3.2 阳性：Ct 值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，表示样本为阳性。 2.3.3 Ct 值大于 38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为 阳性，否则判为阴性。 

【注意事项】 1 实验室应至少分为三个区：样品处理区、反应混合物配制区和检测区。 2 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。 3 Buffer A 有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣服上，否则应立即用大量清水冲洗并擦干。 4 在整个检测过程中应注意避免交叉污染：提取核酸时应用灭菌的镊子夹取离心管；对离心管 开盖时应避免粘在手上或溅出，否则要立即更换手套。 5 反应液在使用前要*融化，并将反应液与 Taq 酶瞬时离心将液体甩至管底。分装反应液时， 应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6 阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡 1~2 秒。 7 试剂盒中各组分应避免反复冻融。 8 对样品及其废弃物的操作应严格遵守生物安全规定。 9 本试剂盒仅供兽医及相关专业人士使用。

【贮藏与有效期】非洲猪瘟病毒荧光 PCR 检测试剂盒（B 盒）在-20℃保存，有效期为 12 个月。 

【规格】48 检测/盒。 

【批准文号】兽药生字 191478858 

仅供兽医诊断使用