单核细胞增生李斯特菌核酸检测试剂盒 (PCR法)

【产品概述】

李氏杆菌病是由单核细胞增生李斯特菌引起的一种急性或慢性传染病。本病可分为子宫炎型、败血型和脑炎型。在家畜中，绵羊的李氏杆菌病最为常见，并几乎全为脑炎型，各种年龄和性别的绵羊都可患病；败血型间或发生于10日龄以下的羔羊；子宫炎型多发生于怀孕最后两个月的头胎绵羊。山羊的病型与绵羊的相同。

本试剂盒应用聚合酶链反应（PCR）方法，可快速、准确地定性检测单核细胞增生李斯特菌DNA，适用于单核细胞增生李斯特菌的检测、诊断和流行病学调查。

【检测原理】

 以提取的待检样本的DNA为模板，在PCR反应体系中，低温条件下引物与互补的模板形成双链，72℃时在Taq DNA 聚合酶作用下，以dNTP 为原料，以引物为复制的起点，沿模板合成一条新链。每个循环包括：高温变性、低温退火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的DNA 片段拷贝数放大一倍。经过35 次循环，使扩增的DNA 片段放大了数百万倍以上。将扩增产物进行电泳，经核酸染料染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA 片段的扩增带。

【试剂盒组成】

* 质控品说明：阴性质控品用于对环境进行监控，阳性质控品用于对检测试剂进行监控。

【自备物品】

1.   仪器：分析天平、离心机、PCR 扩增仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器等；

试剂：DNA提取试剂、核酸染料(如EB、GoldView II)、DNA Marker(如TaKaRa 1.   DL2000)、Loading Buffer、1×TAE(电泳缓冲液)、琼脂糖、双蒸水等；

2.   耗材：称量纸、吸头、量筒、500ml锥形瓶等。

【使用方法】

注：所有试剂使用前须*解冻，混合均匀后于5,000rpm离心数秒后使用。

1. 样本处理（样本处理区）

待检样本的核酸提取可采用核酸提取试剂盒，具体提取方法请参照相应说明书；阳性质控品及阴性质控品无需提取，已包装在试剂盒内，可直接使用。

2. 扩增试剂准备（配液区）

取N个（N=阴性质控品+待检样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入PCR反应液19.6μl、PCR酶0.4μl (也可按照每头份用量，计算N+1头份PCR反应液、PCR酶各自所需总量，两者混匀离心后分装20μl至单个PCR反应管)。

扩增试剂加好后将所有PCR反应管于5,000rpm离心10s，转移至样本处理区。

3. 加样（样本处理区）

在上述的PCR反应管中分别加入待检样本核酸提取物、阴性质控品和阳性质控品各5μl，盖紧管盖，于5,000rpm离心10s，转移至扩增区。

 4. PCR扩增（检测区）

         94℃ 3min；

         94℃ 30s

         55℃ 30s

         72℃ 30s

         72℃ 7min；

         4℃  Hold；

         设置25μl体系。

5. 电泳检测（电泳区）

称4g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入200ml 1×TAE电泳缓冲液，于微波炉中熔解，室温冷却10min后加入10μl核酸染料混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10~20μl，加入终浓度1×的上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，100~120V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳至溴酚蓝处于凝胶1/2处（约30min），紫外灯下观察结果。

    【结果判断】

阳性对照出现320bp扩增带、阴性对照无该位置的特异条带出现（引物带除外），实验结果成立，否则视为无效。被检样品出现320bp扩增带为单核细胞增生李斯特菌阳性，否则为阴性。

【注意事项】

1． 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

2． 实验请严格分区操作：流程顺序为配液区→样本提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3． 试剂盒内各试剂使用前，充分融化后请稍事离心。

4． 在-20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

5． 核酸染料低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套，染料和上样缓冲液使用前也请离心使液体沉于管底。

6． 严格遵守操作说明可以获得最H的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

7． 反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在3次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。

【储存条件及有效期】

-20℃保存，避免反复冻融，有效期6个月。

实验代做服务：