氨苄青霉素酶联免疫试剂盒

说明书

一、药物概述及检测原理

 氨苄青霉素类抗生素广谱的抗菌特性，为动物疾病的防治提供了、低毒的有力武器，被大量应用于畜禽养殖业。人食用了氨苄青霉素残留的动物源食品会对身体造成一定危害甚至产生严重的过敏反应，所以对氨苄青霉素残留的有效监测已成为保障食品安全的一个重要环节。

操作流程本公司的氨苄青霉素酶联免疫试剂盒使用zui新生物技术开发，具有方便、快速、灵敏等特点。

本试剂盒利用氨苄青霉素抗体与氨苄青霉素可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和氨苄青霉素抗体，样本或标准品中的氨苄青霉素药物与固定在酶标板上的抗原竞争氨苄青霉素抗体，后加入底物催化显色。此时显色深度与标准品（样本）中氨苄青霉素药物的含量成反比。

二、试剂盒内包含组分：

标准品工作液：0 ppb、0.5 ppb、1.5 ppb、4.5 ppb、13.5 ppb,500ppb，1 mL/瓶。

96孔酶标板：1块

氨苄青霉素抗体工作液：1瓶（7mL/瓶）

酶标Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×浓缩洗涤液：1瓶（30 mL/瓶）

2×浓缩复溶液：1瓶（60mL/瓶）

底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

终止液：1瓶（7mL）

说明书

盖板膜

自封袋

三、用户需要自备的设备和试剂

仪器：

v 酶标仪（检测波长450 nm、630 nm）

v 电子天平（精度：0.01 g）

v 离心机（4000 g及以上）

v 生化培养箱（可调25℃）

v 摇床

v 旋涡振荡器

v 氮吹仪

v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排枪）

v 计时器

试剂：

v 乙腈

v 氢氧化钠

v 正己烷

v 去离子水

四、试剂盒特异性

　　　试剂盒与其他药物的交叉反应率：

v 氨苄青霉素…………………………………100%

五、样本检测步骤

1. 工作液准备

v  0.1M 氢氧化钠溶液(组织提取用)：称取0.4g氢氧化钠加入100ml去离子水溶解混匀。

v 乙腈-0.1M 氢氧化钠溶液(组织提取用)： 量取84ml乙腈加入16ml 0.1M 氢氧化钠溶液中，混匀。

v 复溶工作液：取1份2×浓缩复溶液加去离子水1份按照1:1的比例稀释即得。

v 洗涤工作液：取1份20×浓缩洗涤液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

2. 样品前处理

组织方法一（鸡肉、猪肉、鱼、虾）（稀释倍数：4）   

Ø 用均质器均质组织样本；

Ø 称取1±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氢氧化钠溶液（见5.1），用振荡器振荡10min，3000g室温离心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml洁净干燥玻璃管中，于60℃水浴氮气流下吹干；

Ø 加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，溶解干燥残留物，再加入1ml复溶工作液（见5.2），用涡旋仪涡动30s，充分混匀后转入2ml聚苯乙烯离心管中，3000g室温离心5min；

Ø 除去上层有机相，取下层50μL 用于分析。

Ø 注：批量检测样本时使用本公司代理配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

组织方法二（鸡肉、猪肉、鱼、虾）（稀释倍数：20）   

Ø 用均质器均质组织样本；

Ø 称取1±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氢氧化钠溶液（见5.1），用振荡器振荡10min，3000g室温离心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml洁净干燥玻璃管中，于60℃水浴氮气流下吹干；

Ø 加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，溶解干燥残留物，再加入1ml复溶工作液（见5.2），用涡旋仪涡动30s，充分混匀后转入2ml聚苯乙烯离心管中，3000g室温离心5min；

Ø 除去上层有机相，取下层水相与复溶工作液（见5.2）按1：4体积比进行稀释（50μL样本液+200μL复溶工作液）；

Ø 取50μL用于分析。

Ø 注：批量检测样本时使用本公司代理配套的GK-201型有机相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

3. 检测

Ø 准备：将要使用的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动建议做双孔平行实验（每个样本/标准品点两孔），未使用的酶标板条用自封袋密封后，保存于2-8℃环境中以防变质；

Ø 加样：向对应微孔中加入标准品工作液/样品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL抗体工作液；

Ø 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应30 min；

Ø 洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加250 μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；

Ø 加样：向每孔中加入100 μL酶标二抗工作液；

Ø 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应30 min；

Ø 洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加250 μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；

Ø 显色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必须按体积1:1充分混合，混合液在10 min内使用，切不可使用金属容器盛装、搅拌试剂以免底物变质失效）；

Ø 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应15 min；

Ø 终止：在反应后的微孔中加入终止液50μL/孔，底物液由蓝变黄表明终止成功。

Ø 读数：终止后的酶标板应在5 min内用酶标仪读数，建议使用450 nm、630 nm双波长读取酶标板吸光度值。

4. 计算结果

Ø 设各标准品（或样品）的吸光度平均值为B，零标准（浓度为0 ppb的标准品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%为各标准品（或样品）对应的吸光度的百分比：

Ø 使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。

Ø 将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

六、试剂盒参数

Ø 试剂盒灵敏度：0.5ppb；

Ø 标准曲线范围：0.5ppb-13.5ppb；

Ø 板内变异系数：<5%；

Ø 板间变异系数：<15%；

Ø B0吸光度zui佳值：>0.8；

Ø 回收率：60%±20%

Ø 样品低检测限：

　组织方法一……………………………约3ppb

  组织方法二……………………………约10ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本试剂盒为定量或半定量试剂盒，建议用于大量样本筛查分析。若检测结果为阳性，建议使用仪器方法开展确证实验（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、试剂盒贮存条件

试剂盒ZUI佳贮存温度为2-8℃，切勿冻存。

未使用完的酶标板条须密封保存2-8℃的环境中。

九、注意事项

使用试剂盒前，请务必仔细阅读说明书。

试剂盒使用前，需将盒内各组份置于实验台上回温至室温（25±2℃）（提示：约1 h）。

试剂在使用前许摇匀，混合时应避免出现气泡。

枪头为一次性用品，为防止试剂交叉污染，检测过程中所用枪头不得重复使用。

请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。

样品处理完毕后请立即分析，否则可能影响检测结果。

底物A液、底物B液均为无色透明液体，若在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已污染或变质。

加样过程在保证精度的前提下一定要迅速，以免反应时间差对检测结果产生影响。

终止液中含有硫酸，若不小心溅上皮肤或衣物请立即用大量清水冲洗。若不慎ru眼，请在*清洗后去医院检查。